荧光抗体技术其实就是把荧光素跟特异性抗体通过共价键连在一起，弄出一个既能保留抗体活性又自带荧光的家伙。这种结合物遇到对应的抗原时，显微镜下就会亮起来，就像打了一束追光一样。其中最常用的就是FITC了，它有好多优点：量子产量高，激发光波长跟流式细胞仪用的那个激光非常接近；稳定性好不容易散架；背景也很干净，不会跟细胞自己的荧光混在一起；标记方法成熟简单，就是把抗体上的赖氨酸和FITC的异硫氰基给连上就行；而且还安全无毒，早就通过FDA检验了；性价比也很高。 想用荧光素标记抗体，得先看它能不能满足这几个要求：得跟蛋白牢牢地形成共价键不能随便掉下来；得有很高的荧光效率，而且标记前后的颜色得明显不一样；不能影响蛋白的生物活性；标记的过程得简单快速还得能重复；最后就是得安全无毒还容易清除掉。 具体操作步骤是这样的：首先给抗体做预处理，用pH9.8的碳酸氢钠缓冲液把它稀释到1到5毫克每毫升，或者直接透析，目的是把赖氨酸的氨基露出来但又别让蛋白变性了。这一步全程都要避光。接着就是偶联反应，把透析袋泡在含FITC的pH9.8碳酸氢钠缓冲液里搅拌过夜。这一步pH绝对不能变了，一变偶联率就会低很多。然后是终止和透析，把反应液转到PBS透析袋里换三次以上的液直到吸收值为零。再加入叠氮钠防止污染和安全问题。最后就是质量控释了，用F/P值来判断标记效果。这个值的正常范围是0.3到1.0之间。如果超过1.0就说明FITC加多了，如果低于0.3就说明不够。 做实验的时候要注意几点：全程必须避光，哪怕换个瓶子也要用锡纸包住；pH是生命线一定要用仪器测准；Tris、氨、叠氮钠这些东西都会抢反应位点得先排雷；如果背景太乱多半是透析没干净得多换几次液试试；第二抗体最好直接买现成的省事儿又质量好；如果一抗需要标记优先选现成的FITC-IgG比较省事。 把这些步骤和控制点掌握住了以后，就能把任何抗体变成能发光的侦探了。不管是在细胞里还是在组织里甚至在活体内都能精准定位目标抗原让实验结果更靠谱。