细胞实验总是要面对各种问题，不过只要抓住这几个关键点，就再也不用担心了。细菌、真菌、霉菌这些家伙躲在培养箱里，你要是不小心犯了错，它们就会突然出来捣乱。虽然看起来很吓人，但其实每种污染都有救的方法。 细菌污染最容易认出来，镜下有小黑点，闻着还有股臭鸡蛋味。这时候赶紧在培养基里加点抗生素，不过抗生素会伤细胞，状态不好了可就很难恢复。最好的办法还是平时操作再小心点，台面、瓶口、枪头都要弄得干干净净。 真菌污染早期看着培养液还是清亮的，但镜下能看见丝状的东西，慢慢就会长出黑色的绒毛。一旦发现这种情况，这瓶培养液直接扔掉别犹豫，然后把整个培养间、孵箱都用酒精和新洁尔灭彻底消毒一遍。 霉菌污染的症状跟真菌差不多，也是清亮培养液里漂着絮状的东西。细胞还能长就是速度变慢了，处理方法和真菌一样，果断扔掉再消毒。 支原体污染虽然培养液不浑，但细胞状态会突然变差，镜下能看见小黑点或者空泡化的细胞漂浮着。如果不是什么珍贵的细胞系，直接扔掉是最省心的选择。想自己救回来的话试试换批次血清再用抗生素处理一下，不过成功率不高。 黑胶虫对细胞没什么毒性，400倍镜下能看见点状的小体在游动。提高种板密度和尽早处理能减少损失，如果数量太多换掉血清就行了。 传代的时候得让细胞乖乖听话才行。贴壁细胞和悬浮细胞的操作要点不一样。常规细胞用0.05%的胰酶就够了；难消化的细胞可以用0.25%的胰酶加少量EDTA；细胞密度超过80%的时候就得分步消化。 第一次开瓶的胰酶要立刻分装保存，避免反复冻融影响活性。消化时间宁短勿长，看到细胞变圆了就赶紧停下来吹下来。 悬浮细胞密度太高容易抱团成团块大的可以用细胞筛过滤掉或者静置20分钟取上清液。千万别用力吹打以免把活细胞也弄死。 空泡多了也不一定是正常现象要看数量和比例少数可能是状态不好多数空泡提示老化了可以通过调整血清浓度或者减少传代频率来改善如果代次太高直接换批次更稳妥。 消化过度、传代过密、营养失衡、代代相传、状态老化、隐匿污染未发现这几个问题都会导致生长放缓得逐条排查才能对症下药。 接触抑制型的细胞不要等长满了才传代70%-80%汇合度的时候就该传代了提前记录自己细胞的临界点守时传代才能高产稳产。 复苏和冻存是细胞保存的两条生命线一步走错就全完了复苏时37℃水浴快速解冻后离心洗掉DMSO冻存的时候用PBS洗两遍再按5-10×10⁶/mL重悬于含DMSO不超过10%的冻存液里按照梯度降温的方法放入液氮中保存。 解冻速度越快存活率越高别忘了次日换液一次彻底清除残留DMSO无论选择哪种冻存程序都要记录日期和梯度曲线方便以后复苏追踪。