石蜡切片的全流程优化指南主要有两步，一步是石蜡切片，另一步是冰冻切片。先说说石蜡切片的6个黄金步骤。第一就是取材，手起刀落一定要快，因为组织离体后细胞结构就开始变化了。第二是固定，最好现配现用，固定液效力超过4小时就没那么好了。固定液要比组织块大20到30倍，水分多的组织中途还得换一次液，避免“夹生”。第三是脱水，用有盖瓶的乙醇逐级脱水，每一级停留别超过5分钟。要是不小心脱不干透，到了透明环节会看到白色雾状的东西，前功尽弃。第四就是透明，动作要快、准、稳，盖子随时盖紧防止水汽进入。要是看到白色雾状就得返工去脱水。第五步是透蜡，低温恒温最好。石蜡温度别让它凝固了，恒温箱设定在56度左右就行。透蜡时间别超过30分钟，要是组织变得像木屑那么硬就说明失败了。最后一步是切片了，锁定手轮再启动机器。刀刃全程被护刀罩遮盖住，匀速转动手轮就行了。碰到硬组织就减速切，软组织加速切一次。这样切出来的片子不容易出现裂纹。 接下来是冰冻切片的“三要素”：包埋剂用量、冷冻温度和刀片状态。包埋剂用托架预冷30秒后先点少量胶放组织上去再补胶周围就好。厚度控制在1毫米左右就行。冷冻温度要根据组织类型来定，通常哺乳动物用-18度左右比较合适。刀片要是出现毛边就赶紧换一个新的，刀刃越锋利切片才会越完整。 载玻片直接放在室温下存放就可以了，不用额外去冷冻它们。取片的时候右手握切片机手柄左手持毛刷轻轻扫一下比“点切”更平整一些。 经典染色SOP里面有HE染色、天狼星红胶原染色、PAS反应和MASSON三色这四种方法步骤都不一样但是都有各自的要求和顺序一定要遵循这些顺序才能得到满意的结果呢！比如HE染色需要23个步骤从二甲苯I到II再到III每个步骤都有规定时间呢！还有天狼星红胶原染色也只有6个步骤脱蜡至水再依次染色分化等等也不能省略任何一个步骤呢！PAS反应需要7个步骤从脱蜡至水到过碘酸氧化再到Schiff染液一系列操作呢！MASSON三色也是8个步骤从苏木素到盐酸酒精再到苯胺蓝各种颜色交替进行才能得到满意的结果呢！ 最后的实操效果对比图中展示了小鼠组织HE染色效果还有肿瘤组织CD71单标免疫荧光这些图例清晰背景干净为后续定量分析奠定了基础呢！