问题——微生物群落（如生物膜、菌丝网络）普遍具有高散射、结构复杂等特点；传统共聚焦显微镜依赖紫外或蓝光激发时，往往同时受到散射与吸收的限制：深部信号衰减快、背景更强，光漂白与光损伤风险也随之增加。尤其蓝光区域，固有荧光团虽能提供代谢与生理状态信息，却长期受困于“表层可见、深层难清”的成像瓶颈。 原因——光在高散射介质中传播时会产生大量离焦光，导致背景累积、对比度下降；而短波激发在散射介质中的损耗更明显，继续压缩有效成像深度。多光子显微可利用近红外光在焦点处实现非线性激发，理论上更有利于深部成像，但三光子成像通常需要更复杂的光源方案，成本与调试门槛较高，限制了其在微生物研究中的普及。 影响——针对这些难点，研究团队搭建了一套基于超快镱光纤激光器的多光子成像系统，用单一波长（1040纳米）同时驱动双光子与三光子过程，实现链霉菌群落固有荧光的同步、多通道采集。系统采用一体化光纤激光器输出，脉冲宽度约180飞秒、重复频率可调（实验采用4.17兆赫兹）、脉冲能量最高约400纳焦耳；经色散补偿后，由高数值孔径物镜聚焦。荧光信号采用非解扫描方式收集，并分为蓝、绿、红三个光谱通道，分别对应三光子主导、混合激发以及双光子主导的信号来源。功率依赖性测试显示，蓝色通道信号与激发功率近似三次关系、红色通道近似二次关系，验证了同步激发机制的可控性与可重复性。 在深度成像对比中，三光子激发表现出更强的轴向限制能力，能更有效抑制焦外背景，从而在高散射样品中维持更高信噪比：在低密度样品的数百微米深处，三光子通道仍保持可用对比度，而双光子通道更早出现细节丢失；在更高散射条件下，三光子成像优势进一步扩大。极限测试中，团队实现约780微米深度的三光子成像，仍可分辨链霉菌丝状结构，为观察微生物群落内部的空间组织提供了新的手段与证据。研究同时指出，使用1040纳米近红外光实现等效短波激发，可在降低散射损耗的同时减少光损伤风险，为长时间、活体条件下的观测提供可能。 对策——面向更广泛应用，业内人士认为还需在三上继续推进：一是补充不同密度、含水量样品的成像参数与损伤阈值评估，形成可复用的实验规范；二是提升系统稳定性与多通道定量能力，使固有荧光信号与代谢物分布的关联能够被持续、可靠地追踪；三是推动仪器工程化，围绕单光源、少调试、易维护的设计思路降低使用门槛，服务微生物生态、药物筛选与合成生物学等应用场景。 前景——随着无标记深层成像能力提升，未来有望在不切片、不染色条件下，对生物膜耐药形成、链霉菌次级代谢产物分布、微生物群落协同与竞争等关键过程进行原位观测，并与光谱分析、功能成像等方法结合，实现从“看结构”走向“看功能”。同时，单一波长同步驱动多光子过程的思路也有望拓展至更多组织样品与复杂生物体系，为深部微观成像提供更易获得的技术路径。
这项工作展示了光学工具创新对生命科学研究的推动作用。随着研究对观测能力的依赖不断加深，我国科学家通过跨学科融合与原创技术路线，提供了更具实用性的深部成像方案。随着更多可靠、易用的“科研之眼”落地，微观世界的可见范围与解析深度有望更扩大。